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革蘭氏染色液技術(shù)

文章出處:本站 人氣:5590 發(fā)表時間:2019-03-23 12:58:32


作者經(jīng)過對比試驗,研究了菌齡、涂片厚度、媒染時間、脫色時間的變化對革蘭氏染色液結(jié)果的影響。結(jié)果表明:革蘭氏染色時,大腸桿菌培養(yǎng)24h左右為宜,而枯草芽孢桿菌培養(yǎng)15h左右為宜;涂片厚度應(yīng)均勻薄片;媒染時間控制在60s;脫色時間應(yīng)嚴(yán)格控制在25~30s。
關(guān)鍵詞: 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 革蘭氏染色 影響因素
革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的種重要的鑒別方法,而實驗成功率低,常常出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果,對初學(xué)者來說難度較大。因此,我們選取大腸桿菌作為G代表,枯草芽孢桿菌作為G代表,分析影響革蘭氏染色結(jié)果的各種因素,提高染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。
1.實驗材料
1.1菌種:大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。
1.2試劑:草酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、番紅染液。
2.實驗方法和結(jié)果
2.1菌齡對染色結(jié)果的影響
革蘭氏染色要求菌種被染色時處于活躍生長期。大腸桿菌的活躍生長期為24h左右,枯草芽孢桿菌活躍生長期為在14~16h,故對不同培養(yǎng)時間的菌種分別選擇10個時間段進(jìn)行革蘭氏染色觀察。實驗結(jié)果見表1。
由表1可見,培養(yǎng)時間對染色結(jié)果影響較大,不同菌種對培養(yǎng)時間有不同要求。處于活躍生長期的菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)為典型,能正確反映染色的結(jié)果。其中,大腸桿菌培養(yǎng)24h左右為宜,而枯草芽孢桿菌培養(yǎng)15h左右為宜。
2.2涂片厚度對染色結(jié)果的影響
用直徑3mm的接種環(huán)分別挑起培養(yǎng)24h左右的大腸桿菌和培養(yǎng)15h左右的枯草芽孢桿菌滿環(huán)、半環(huán)、更少量涂片,從中央向外圍涂開,使細(xì)菌在小滴生理鹽水中涂成直徑約1cm的菌膜,堆積密度由濃厚到均勻分散,作革蘭氏染色觀察。結(jié)果顯示:涂片濃厚時,大腸桿菌因密集脫色不完全而呈陽性反應(yīng),枯草芽孢雖呈陽性但是染色均勻度欠佳;涂片太薄,菌體過于稀少,觀察時尋找視野較麻煩。因此,只有在菌膜厚度均勻分散、肉眼能見無菌生理鹽水稍顯渾濁時,才能得到較佳的染色結(jié)果。
2.3媒染時間對染色結(jié)果的影響
將培養(yǎng)24h左右的大腸桿菌和培養(yǎng)15h左右的枯草芽孢桿菌革蘭氏染色,碘液作為媒染劑,覆蓋時間分別為30s、60s、90s、120s。實驗結(jié)果見表2。
由表2可見,媒染時間過短,不利于結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物與細(xì)胞之間的結(jié)合,可能造成枯草芽孢桿菌(G)呈假陰性的結(jié)果,但對大腸桿菌(G)無影響;反之,媒染時間過長,結(jié)合過于牢固,容易造成大腸桿菌(G)假陽性的結(jié)果,但對枯草芽孢桿菌(G)影響非常小。因此,媒染時間應(yīng)控制在60s為宜。
2.4乙醇脫色對染色結(jié)果的影響
脫色是影響革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟,脫色時間直接關(guān)系到染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們選擇10s至60s的脫色范圍,分6個時間分別進(jìn)行實驗。實驗結(jié)果見表3。
由表3可見,脫色程度不夠,大腸桿菌(G)可被染成假陽性,對枯草芽孢桿菌(G)影響較小;脫色過度,枯草芽孢桿菌(G)容易成假陰性,對大腸桿菌(G)影響較小。這是由于酒精脫色時間長使得細(xì)胞壁中脂類物質(zhì)易被溶解,細(xì)胞通透性增大,導(dǎo)致結(jié)晶紫—碘復(fù)合物易被抽提出來;反之,脫色時間短,復(fù)合物就不易從細(xì)胞壁中逸出,而兩種菌種化學(xué)組成有差別,染色受影響程度不樣。因此,革蘭氏染色時,定要嚴(yán)格控制酒精脫色時間,般以25~30s為宜。
3.結(jié)果分析
通過以上實驗和分析,我們認(rèn)為菌齡、細(xì)菌密集程度、媒染時間、酒精脫色程度這幾個因素都會影響革蘭氏染色液結(jié)果的正確性,同時還受干燥、固定等操作的影響。因此在進(jìn)行革蘭氏染色實驗教學(xué)和科研工作中,除操作正確適當(dāng)外,更重要的是選擇適合的菌齡和準(zhǔn)確把握脫色時間,這樣才能保證染色結(jié)果的正確性。


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